細(xì)胞凋亡檢測(cè)是生物學(xué)研究中一項(xiàng)重要的技術(shù)，廣泛應(yīng)用于疾病機(jī)理研究、藥物篩選等領(lǐng)域。今天，我們就來(lái)詳細(xì)介紹如何使用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。
實(shí)驗(yàn)原理
在細(xì)胞凋亡早期階段，細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸（PS）從胞質(zhì)轉(zhuǎn)至胞外，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中，細(xì)胞膜通透性增加，從而被PS特異的Annexin-V探針標(biāo)記。
Annexin-V為Ca2+依賴(lài)性磷脂結(jié)合蛋白，對(duì)PS有極強(qiáng)的結(jié)合力。PI是一種經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定的核酸染料，它不能透過(guò)正常細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞的完整的細(xì)胞膜，但可以透過(guò)凋亡晚期和壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。
將Annexin V與PI聯(lián)合使用時(shí)，PI被排除在活細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞之外，而晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞同時(shí)被FITC和PI結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽(yáng)性。
實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備
Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒
細(xì)胞樣本（懸浮細(xì)胞或貼壁細(xì)胞）
離心機(jī)
PBS
熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀
實(shí)驗(yàn)方法
1. 細(xì)胞收集
懸浮細(xì)胞：1000 g 離心 5 min，棄去上清。加入 1 mL 預(yù)冷的 PBS 輕輕重懸細(xì)胞沉淀，1000 g 離心 5 min，棄去上清，保留細(xì)胞沉淀。
貼壁細(xì)胞：小心吸取細(xì)胞培養(yǎng)液保存?zhèn)溆谩＜尤?PBS 洗滌后，加入適量胰酶消化液（盡量不含 EDTA，以免影響 Annexin V 和 PS 的結(jié)合）消化細(xì)胞。加入前面收集的培養(yǎng)液，輕輕吹打細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，1000 g 離心 5 min，棄去上清。加入 1 mL 預(yù)冷的 PBS 輕輕重懸細(xì)胞沉淀，1000 g 離心 5 min，棄去上清，保留細(xì)胞沉淀。 注：建議胰酶消化液不含 EDTA。
2. 重懸細(xì)胞
加入 195 μL Binding Buffer，輕輕重懸細(xì)胞，使其重懸至適宜濃度。
3. 加入染料
①加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻。 Annexin V-FITC 用于檢測(cè)早期凋亡細(xì)胞（磷脂酰絲氨酸外翻）。
②加入 10 μL PI Stain，輕輕混勻。 PI 用于檢測(cè)晚期凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞（DNA 染色）。
4. 孵育
室溫下避光孵育 10-20 min，使染料與細(xì)胞充分結(jié)合。
檢測(cè)與分析
流式細(xì)胞儀檢測(cè)
1. 設(shè)置合適的通道檢測(cè) Annexin V-FITC 和 PI 的熒光信號(hào)。
2. 三組對(duì)照的設(shè)置非常重要，可以幫助校正背景信號(hào)和確定凋亡細(xì)胞的比例。
未染色組：用于檢測(cè)自然熒光。
PI 單染組：用于確定 PI 的陽(yáng)性閾值。
Annexin V-FITC 單染組：用于確定 Annexin V 的陽(yáng)性閾值。
熒光顯微鏡檢測(cè)
1. 離心后用少量 Binding Buffer 重懸細(xì)胞，涂片。
2. 在熒光顯微鏡下觀察，通常 Annexin V-FITC 發(fā)出綠色熒光，PI 發(fā)出紅色熒光。
3. 可以通過(guò)拍照或計(jì)數(shù)來(lái)定量分析凋亡細(xì)胞的比例。
注意事項(xiàng)
1. 整個(gè)操作過(guò)程中應(yīng)盡量保持低溫，以減少細(xì)胞代謝和染色過(guò)程中的自發(fā)熒光。
2. 避免長(zhǎng)時(shí)間暴露于光線下，特別是 FITC 類(lèi)染料，因?yàn)楣庹諘?huì)導(dǎo)致熒光淬滅。
3. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求調(diào)整細(xì)胞數(shù)量和染料濃度。
4. 如果使用流式細(xì)胞儀，確保儀器已校準(zhǔn)并且通道設(shè)置正確。
結(jié)果解讀
胞凋亡帶logo.png)
左上象限QI：通常為雜質(zhì)或技術(shù)誤差造成的假陽(yáng)性。
右上象限Q2：晚期凋亡或壞死細(xì)胞，Annexin v和PI雙陽(yáng)性細(xì)胞。
右下象限Q3：早期凋亡細(xì)胞，由 Annexin ∨ 標(biāo)記的單陽(yáng)性細(xì)胞。
左下象限Q4：活細(xì)胞，未發(fā)生凋亡的細(xì)胞。
細(xì)胞凋亡率：Q2與Q3象限百分率的和。
